ADL Diagnostic Chile utiliza la técnica PCR y sus variantes más avanzadas (qPCR, RT-qPCR) para detectar patógenos que afectan a los peces con máxima especificidad y sensibilidad, incluso en muestras complejas y con cantidades mínimas de material genético.
Es por ello que la compañía desarrolló la nota técnica N°16: «Principios y Utilidad Diagnóstica de la Prueba de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)», que invita a descubrir los detalles de su uso en la acuicultura.
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es quizás la técnica más relevante en cuanto a biología molecular del último siglo. Es difícil pensar en otro procedimiento de laboratorio que haya tenido un mayor impacto en tantas facetas diferentes de la investigación biológica. Descrita por Kary Banks Mullis en 1983, esta técnica permite obtener más de un billón de copias desde un fragmento de material genético, en solo horas (Mullis K. et al.,1986), recuerdan los investigadores de ADL.
“Gracias a este proceso de amplificación, podemos, por ejemplo, identificar individuos en genética forense, diagnosticar trastornos hereditarios o, como hacemos en ADL, detectar agentes causales de enfermedades, realizar vigilancia epidemiológica, evaluar expresión génica y estados inmunológicos (marcadores), entre otros”, destaca ADL en su ficha técnica.
Para entender y dar contexto sobre la técnica, “debemos tener presente que todas las células, independiente de su origen, poseen material genético, tengan (Eucariotas) o no tengan núcleo (Procariotas). Este material genético se va a componer esencialmente de ADN y, en algunos casos, de ARN, como la situación de los virus que, a pesar de no ser células, también poseen material genético y este suele ser ARN”, explica la compañía.
Desarrollo y operatividad de la técnica
El desarrollo de esta técnica, lleva a interiorizarse a un área de estudio clave denominada biotecnología. “Esta, en resumen, dirige sus esfuerzos a utilizar como “herramientas” componentes de organismos vivos. Para el caso de la PCR, dicha herramienta corresponde a la enzima TaqADN polimerasa. La PCR utiliza la capacidad de esta enzima para sintetizar una nueva cadena de ADN complementaria a una hebra molde (Koutsi et al 2018)”, señalan los investigadores de firma.
En tanto, la PCR utiliza dos partidores que son elegidos durante el diseño experimental de forma tal que delimiten el fragmento de ADN a ser amplificado y otorguen la especificidad y sensibilidad según el objetivo (Ej: fragmento de ADN único presente en una subespecie de la bacteria Aeromona salmonicida).
“Luego de reconocer la secuencia complementaria en la molécula de ADN, los partidores se hibridan y son extendidos cíclicamente mediados por la acción de la TaqADN Polimerasa. Cada ronda de la técnica generalmente comprende entre 20 a 45 ciclos en total; esto implica la desnaturalización del ADN, el apareamiento de los partidores (primers) y la síntesis del nuevo fragmento de ADN a partir del partidor (Amado et al 1999), lo que resulta en un crecimiento exponencial de millones de copias del fragmento seleccionado”, detallan los autores.
La especificidad de esta reacción se mantiene aun cuando en la muestra original exista una mezcla compleja de ácidos nucleicos, permitiendo así trabajar en el laboratorio desde muy bajas cantidades de material genético. Finalmente, la evaluación del resultado de esta amplificación se evalúa en geles de agarosa, donde se compara con estándares de ADN de tamaños conocidos.
Los expertos cuentan que todo este proceso se lleva a cabo en un equipo llamado termociclador, que básicamente permite realizar de forma automatizada y secuencial los ciclos de temperatura. Dependiendo de la variante de la técnica a utilizar, este equipo cambiará en su composición.
“Existen diversos tipos y variaciones de la técnica PCR original que, para efectos de clasificación, recibe el nombre de PCR de punto final o simplemente PCR. Otras derivaciones de la técnica a mencionar son: RT-PCR, qPCR, y qRTPCR”, indica la compañía.
Las técnicas de qPCR y RT-qPCR
En específico, las técnicas de qPCR y RT-qPCR se utilizan de forma rutinaria en la detección de agentes causales para enfermedades infecciosas. “La selección de genes específicos de copia única por genoma (singletones) permiten evaluar la presencia o ausencia del material genético de diversos patógenos en muestras complejas”, explica ADL.
En la compañía, optimizaron la información que la qPCR otorga sobre cada agente. “Por ejemplo, la qPCR-SRS ha sido diseñada para amplificar una región génica única y específica dentro del genoma de la bacteria Piscirickettsia salmonis. Este diseño confiere un alto grado de especificidad independiente del tejido que se esté evaluando”, resaltan.
Asimismo, posterior a un resultado positivo, “hemos diseñado otras reacciones de qPCR anexas que permiten evaluar el Genogrupo (EM-90=A o LF-89=B) y, dependiendo de este, poder identificar entre las cinco Genovariantes (I, II, III, IV y V) identificadas por ADL en Chile (Bohle et al 2014)”, destacan.
Correcta elección de un antibiótico
Una problemática en la acuicultura es también la alta variabilidad intraespecífica presente en el genoma de las cepas de P. salmonis, identificadas en el Genogrupo B (LF-89), que exhiben distintos comportamientos de virulencia dependiendo del hospedero. Además, manifiestan distinta susceptibilidad a los antibióticos, lo que resulta ser de vital importancia a la hora de decidir con qué antibiótico tratar los cultivos en acuicultura.
Es por ello que en ADL, además de discriminar el Genogrupo de las muestras qPCR-SRS positivas entre A (EM-90) o B (LF-89), “también evaluamos posteriormente por qPCR a las agrupadas en B, para determinar a qué Genovariante representan y de esta manera saber con exactitud a qué antibióticos es más o menos sensible o definitivamente resistente nuestra muestra positiva a P. salmonis (SRS). Ello sin necesidad de aislar la bacteria y tan solo en 24 horas (Henríquez et al 2016)”, afirman los autores.
En síntesis, la compañía enfatiza que “estos servicios son un claro ejemplo de cómo la técnica qPCR permite no solo detectar patógenos, sino que también brindar información oportuna de procesos de la industria, como es la correcta elección de un antibiótico”.
